Nuovi biomarcatori nel trapianto renale

Le nostre conoscenze mediche sono passate attraverso fasi conoscitive sempre più avanzate. Dalla medicina basata sull’esperienza alla medicina basata sulle evidenze, fino alla medicina di precisione. Al momento attuale stiamo vivendo quest’ultimo passaggio dovuto allo sviluppo delle nuove tecnologie e in particolare allo sviluppo di nuovi biomarcatori.

Nuovi biomarcatori nel campo del trapianto renale permettono di predire o di diagnosticare precocemente lo sviluppo di un rigetto acuto sia cellulo-mediato che anticorpo-mediato. In questo modo permettono di stratificare il rischio di ogni singolo paziente trapiantato, di porre una diagnosi tempestiva, quando il danno istologico è ancora non significativo, e di individuare i riceventi del trapianto a elevato rischio di rigetto acuto. Come già accennato, i nuovi biomarcatori permettono, a livello molecolare, di rilevare anomalie nelle risposte dell’immunità innata e adattiva, molto prima che tali anomalie determinino danni e si estrinsechino a livello istologico.

Un biomarcatore è una caratteristica che è oggettivamente misurata e valutata come indicatore di un normale processo biologico, di un processo patologico o di una risposta farmacologica a un intervento terapeutico. I biomarcatori vengono studiati attraverso procedimenti di proteomica, genomica, trascrittomica e metabolomica (1).

Le principali caratteristiche dei biomarcatori applicati al trapianto renale sono di avere valori predittivi in termini di sensibilità e di specificità e di avere valori predittivi in termini di falsi positivi e di falsi negativi. Devono essere non invasivi e la loro validazione è essenziale a causa delle variazioni interindividuali e delle variazioni fra un laboratorio e l’altro.

Hanno sostituito i tradizionali metodi di monitoraggio degli eventi clinici che comportavano una serie di errori o di interpretazioni non chiare.

Per esempio, il dosaggio della creatinina sierica è un marker non specifico di danno renale. Parimenti l’esame delle urine è non specifico, come non specifico è lo studio con ultrasuoni. Anche il monitoraggio dei livelli farmacologici degli immunosoppressori è non specifico. La biopsia renale è stata a lungo considerata il gold standard diagnostico. Tuttavia non è esente da complicazioni, è soggetta a variazioni difformi fra gli operatori ed è soggetta a errori di campionamento.

In questa analisi verranno in particolare analizzati nuovi biomarcatori nel trapianto renale come il DNA libero di cellule del donatore, presente nel ricevente, il profilo dell’espressione genica nel ricevente e i biomarcatori rivelabili nelle urine.

La presenza di DNA libero di cellule del donatore presente nel ricevente è dovuta al fatto che un qualsiasi danno a carico del rene donato porta a un incremento del DNA nel circolo del ricevente (2). È un attendibile marker di danno delle cellule endoteliali e può essere elevato in caso di rigetto, di infezioni o di danno del trapianto indotto da farmaci (3).

È ancora dibattuto il reale significato della presenza di DNA libero di cellule del donatore e diverse questioni restano aperte come risulta dalla Tabella 1 (3).

Potenziali benefici	Limiti ed errori
Biomarcatore non invasivo	Possibili errori dovuti alla copresenza di DNA del ricevente insieme al DNA del donatore
Applicabile a tutti gli organi solidi	Spesso non è diagnostico per rigetto dovuto a cellule T
Un incremento si può avere anche 30 giorni prima della comparsa di danni istologici	Elevato anche in patologie diverse dal rigetto
L’assoluta quantificazione del DNA del donatore non è influenzata da modifiche del DNA del ricevente	L’uso non è raccomandabile nel periodo precoce post-trapianto
Evita l’impiego di biopsie protocollari	Non è raccomandabile l’uso nelle 24 ore post-biopsia
Evita l’uso di biopsie non necessarie	In gravidanza fornisce risultati ambigui
Diagnosi non invasiva di rigetto mediato da anticorpi	Possibile confusione nei ritrapianti e nei trapianti multiorgano
Valutazione dell’efficacia di una terapia antirigetto
Indicatore per il trattamento farmacologico del rigetto cronico attivo

Due recenti meta-analisi hanno comunque ben documentato l’importanza del DNA del donatore nella diagnosi di rigetto (4,5). In entrambe le meta-analisi è ben documentato che i livelli di DNA del donatore sono significativamente più elevati nei pazienti con rigetto mediato da anticorpi, mentre tale significatività non si ha nel rigetto mediato da cellule T. Una spiegazione di questo fatto è che nel rigetto mediato da anticorpi si ha un danno della micro-vascolatura con liberazione di DNA dall’endotelio (6), mentre il rigetto mediato da cellule T è essenzialmente un danno interstiziale in assenza di lesioni endoteliali (7).

Il DNA del donatore, oltre a essere diagnostico, ha anche valore prognostico ed è stato documentato come pazienti con elevati livelli di DNA del donatore abbiano un più elevato rischio di cattiva evoluzione del trapianto sul lungo termine (8,9). Una riduzione del filtrato glomerulare, lo sviluppo di anticorpi donatore specifici e la recidiva di rigetto sono maggiori nei pazienti con elevati livelli di DNA del donatore, come documentato nella Tabella 2.

	Statistica	Basso DNA (< 0,5%)	Elevato DNA (> 0,5%)	p
Livello di DNA	Media	0,25	1,76
% Modificazioni del filtrato	Media	–0,40	–8,64	0,004
Presenza di atc contro il donatore		1/37 (2,7%)	17/42 (40,5%)	< 0,00001
Ricorrenza di rigetto		0/37 (0,0%)	9/42 (21,4%)	0,0028

In uno studio chiamato ADMIRAL sono stati studiati 1.094 pazienti (10). È stato eseguito un controllo del DNA del donatore per tre anni dopo il trapianto; inoltre sono state monitorizzate la comparsa di anticorpi contro il donatore, l’evoluzione del filtrato glomerulare e la comparsa di rigetti. Lo studio ADMIRAL ha confermato che livelli di DNA persistentemente elevati sono associati a una riduzione del filtrato > 25% nell’arco di tre anni, allo sviluppo di anticorpi contro il donatore e alla più frequente comparsa di rigetti anche subclinici.

In conclusione, il DNA del donatore presente nel ricevente ha certamente importanti benefici, ma anche limiti fra i quali quello di non distinguere spesso rigetti mediati da cellule T e il fatto di poter essere elevato in patologie diverse dal rigetto acuto.

Diversi studi hanno riconosciuto l’importanza del profilo genico nella diagnostica della flogosi precoce e del rigetto subclinico dopo trapianto renale.

Profilo dell’espressione genica come biomarcatore

Il profilo dell’espressione genica sia nelle urine che in circolo può essere significativo per la diagnosi di rigetto acuto. Lo studio CTOT-04 (11) ha documentato come il profilo di 3 particolari geni nei campioni urinari sia capace di svelare reazioni di rigetto. Parimenti, lo studio CTOT-01 (12) ha documentato come la presenza nelle urine della proteina CXCL9 di derivazione genica sia indicativa di rigetto. Lo studio successivo CTOT-08 (13), analizzando l’espressione genica di 120 geni, ha documentato come l’aumento o la riduzione di questi era in grado di distinguere soggetti con trapianto ben funzionante da soggetti con rigetto subclinico. Uno studio genico particolarmente importante è stato quello di Zhang et al. (14) che, in 191 pazienti trapiantati di rene, ha individuato un profilo di 17 geni che è in grado di documentare un rigetto subclinico con elevata significatività. La Tabella 3 riporta i geni con la loro significatività.

Simbolo	Sequenza	Nome	p
ZMAT1	NM_001011657	Zinc finger, matrin type 1	0,01
ETA A1	NM_019002	Ewing tumor, associated antigen 1	0,04
ZNF493	NM_001076678	Zinc finger protein 493	0,002
CCDC82	NM_024725	Coiled-coil domain containing 82	0,02
NFYB	NM_006166	Nuclear transcription factor Y, β	0,03
SENP7	NM_001077203	SUNO1/sentrin specific peptidase 7	< 0,001
CLK1	NM_001162407	CDC-like kinase 1	0,01
SENP6	NM_001100409	SUMO1/sentrin specific peptidase 6	0,01
C1GALT1C1	NM_001011551	C1GALT1C1-specific chaperone 1	0,01
SPCS3	NM_021928	Signal peptidase complex subunit 3 homolog (6, cerevisiae)	0,03
MAP1A	NM_002373	Microtubule-associated protein 1 A	0,01
EFTUD2	NM_001142605	Elongation factor Tu GTP binding domain containing 2	0,001
AP1M1	NM_001130524	Adaptor-related protein complex 1, mu 1 subunit	> 0,001
ANXA5	NM_001154	Annexin A5	< 0,001
TSC22D1	NM_001243797	TSC22 domain family, member 1	0,01
F13A1	NM_000129	Coagulation factor XIII, A1 polypeptide	0,02
TUBB1	NM_030773	Tubulin, β1 class VI	0,03

Forse il più importante studio mediante la valutazione del profilo genico è il TruGraf, che è un algoritmo che utilizza l’espressione genica di 120 geni (15). Un importante studio che ha utilizzato il TruGraf è stato condotto in modo prospettico in 240 pazienti trapiantati di rene (16). La copresenza di molti dei 120 geni era associata a un peggioramento degli aspetti istologici con un ridotto filtrato glomerulare e con una maggiore perdita dell’organo trapiantato. È stata utilizzata anche la combinazione del profilo dell’espressione genica con il reperto di più elevate quantità del DNA del donatore (17). I due metodi usati insieme assumono un più elevato valore diagnostico nella diagnostica del rigetto subclinico. In particolare il profilo genico è più efficace nella diagnostica del rigetto cellulare, mentre i livelli di DNA del donatore sono più efficaci nella diagnostica del rigetto mediato da anticorpi.

Profilo dell’RNA urinario nella diagnostica del rigetto

Anche lo studio del profilo dell’RNA urinario ha dimostrato di essere un biomarcatore utile nella diagnostica precoce del rigetto del trapianto renale.

Aumentati livelli di mRNA perforina e di mRNA granzyme sono presenti nelle urine in corso di rigetto acuto (18).

In un altro studio (19) è stato studiato l’RNA messaggero in 485 pazienti trapiantati ed è stato documentato che nelle cellule urinariei livelli di mRNA di CD ε perforina, di proteina 10 interferone inducibile (IP-10) di 18SrRNA erano diagnostici per rigetto acuto.

Anche i livelli di mRNA per FOXP3 e per CD25 erano diagnostici per rigetto acuto in un altro studio (20). L’utilità delle citochine urinarie per la diagnostica del rigetto acuto è tuttavia discussa. Uno studio francese (21) e uno studio recente (22) non hanno documentato in effetti l’utilità del monitoraggio citochinico urinario nella diagnostica del rigetto.

In conclusione, il profilo urinario dell’RNA sembra importante nella diagnostica del rigetto. Di particolare utilità sembrano la perforina, il granzyme B e IP-10, mentre sono discussi CXCL9 e CXCL10.

In conclusione, molteplici nuovi biomarcatori non invasivi stanno cambiando la facilità e la rapidità nella diagnostica del rigetto e permettono un più precoce ed efficace trattamento con gli immunosoppressori.

Disclosures

Conflict of interest: The Authors declare no conflict of interest.

Financial support: This research received no specific grant from any funding agency in the public, commercial, or not-for-profit sectors.